چالشهای ایمنی در تولید mRNA در شرایط آزمایشگاهی
در صنعت، تولید mRNA از طریق فرایند (IVT) انجام میشود.
این فرآیند علاوه بر تولید mRNA هدف، بهطور همزمان موجب شکلگیری ناخالصیهایی مانند RNA دو رشتهای (dsRNA) میشود که از نظر ایمنیزایی اهمیت بالایی دارند.
حضور dsRNA میتواند پاسخ ایمنی ذاتی را فعال کرده و با مهار سنتز پروتئین در سلول، اثربخشی درمان مبتنی بر mRNA را کاهش دهد.
در نتیجه، حذف این ناخالصیها از نمونههای mRNA برای افزایش کارایی ترجمهی پروتئین ضروری است.
اصول کروماتوگرافی IP-RP در جداسازی RNA
کروماتوگرافی فاز معکوس با ترکیب جفت یونی (Ion-pair reverse-phase) یا (IP-RP) روشی مؤثر برای تصفیه mRNA است که بر تفاوت در اندازه و هیدروفوبیسیتهی مولکولهای RNA تکیه دارد (شکل۱).
الگوی جداسازی RNA در گرادیان خطی CAN در ستونهای IP-RP
در روش گرادیان خطی، غلظت استونیتریل (ACN)که بهعنوان ماده شوینده از ستون کاربرد دارد، بهتدریج از ۷٫۵٪ به ۱۸٪ افزایش مییابد که باعث میشود گونههای مختلف RNA در مراحل خاصی از ستون جدا شوند.
قطعات کوتاه RNA و RNA دو رشتهای (dsRNA) در غلظتهای پایینتر ACN خارج میشوند، درحالیکه mRNA کامل و با خلوص بالا در غلظتهای میانی شویش میشود.
ابزارهای تحلیلی مانند داتبلات (dot- blot) نشان میدهند که فرکشنهای میانی حاوی mRNA خالص و عملکردی هستند، با بازیابی بیش از ۷۶٪ در شرایط دمای اتاق (شکل۲).
روش سادهشده با شویش مرحلهای (Step Elution)
روش جایگزین و سادهتر، کروماتوگرافی IP-RP با شویش مرحلهای (step elution) است.
بهجای استفاده از گرادیان پیوسته، این روش از غلظتهای ثابت ACN برای جداسازی استفاده میکند.
پس از تصفیه اولیه mRNA با ستون Oligo dT، mRNA روی ستون SDVB که منظور همان ستون IP-RP شرکت به نام SARTORIUS است بارگذاری میشود و توالیای از شویشها با ACN ابتدا در ۸٫۵٪، سپس شویش اصلی در ۱۱٫۷٪، و در نهایت پاکسازی نهایی در ۱۸٪ برای حذف ناخالصیها بهکار میرود.
این روش باعث سادهسازی فرآیند، حذف نیاز به جمعآوری فرکشنهای متعدد، دستیابی به بازدهی تا ۸۵٪ و امکان مقیاسپذیری صنعتی میشود (شکل۳).
تصفیه saRNA : چالشها و راهکارها
RNAهای خودتقویتشونده (self-amplifying RNA)یا (saRNA) به دلیل طول زیاد (~۹۸۰۰ نوکلئوتید) و احتمال بالاتر آلودگی با dsRNA، به تصفیهای دقیقتر نیاز دارند.
روشهای IP-RP در دمای اتاق برای saRNA کارایی کافی ندارند؛ بنابراین از گرادیان خطی ACN در دماهای بالا (۳۸ تا ۵۰ درجه سانتیگراد) استفاده میشود.
این شرایط باعث جداسازی مؤثر dsRNA و دستیابی به saRNA با خلوص بالای ۹۰٪ میگردد.
اثربخشی زیستی saRNA تصفیهشده و تستهای ایمنی
آزمایشهای عملکردی نشان دادهاند که saRNAهای تصفیهشده با این روش، توانستهاند میزان بیان پروتئین را تا ۱۷ برابر افزایش دهند. همچنین، نیاز به دوزهای بالای RNA برای تحریک پاسخ ایمنی بهطور قابلتوجهی کاهش یافته است.
این نتایج، اثربخشی بالا و ایمنیزایی پایینتر saRNA و mRNA تصفیهشده را در مقایسه با نمونههای تصفیهنشده بهخوبی اثبات میکنند.
عبارت کلیدی:
ستون مونیلیتی SDVB: ستون مونیلیتی SDVB ساخت شرکت Sartorius، ستونی یکپارچه با پایه پلیمری است که برای تصفیه RNAهای بزرگ مانند mRNA و saRNA با سرعت و کارایی بالا در روش IP-RP بهکار میرود.
𝐑𝐞𝐯𝐞𝐫𝐬𝐞-𝐩𝐡𝐚𝐬𝐞 𝐜𝐡𝐫𝐨𝐦𝐚𝐭𝐨𝐠𝐫𝐚𝐩𝐡𝐲 𝐫𝐞𝐦𝐨𝐯𝐞𝐬 𝐝𝐨𝐮𝐛𝐥𝐞-𝐬𝐭𝐫𝐚𝐧𝐝𝐞𝐝 𝐑𝐍𝐀, 𝐟𝐫𝐚𝐠𝐦𝐞𝐧𝐭𝐬, 𝐚𝐧𝐝 𝐫𝐞𝐬𝐢𝐝𝐮𝐚𝐥 𝐭𝐞𝐦𝐩𝐥𝐚𝐭𝐞 𝐭𝐨 𝐝𝐞𝐜𝐫𝐞𝐚𝐬𝐞 𝐢𝐦𝐦𝐮𝐧𝐨𝐠𝐞𝐧𝐢𝐜𝐢𝐭𝐲 𝐚𝐧𝐝 𝐢𝐧𝐜𝐫𝐞𝐚𝐬𝐞 𝐜𝐞𝐥𝐥 𝐩𝐨𝐭𝐞𝐧𝐜𝐲 𝐨𝐟 𝐦𝐑𝐍𝐀 𝐚𝐧𝐝 𝐬𝐚𝐑𝐍𝐀
