در دنیای ویرایش ژنوم، ابزارهای مبتنی بر CRISPR به طور گسترده‌ای برای ایجاد تغییرات دقیق در DNA استفاده می‌شوند. بااین‌حال، یکی از چالش‌های بزرگ در Prime Editing تولید RNAهای هدایتگر بلند و اصلاح‌شده شیمیایی (pegRNA) است که کارایی ویرایش را بهبود بخشد. این RNAها بخش مهمی از سیستم ویرایش ژنی هستند و به دلیل طول زیاد و نیاز به اصلاحات شیمیایی، ساخت آن‌ها بسیار چالش‌برانگیز بوده است.
پژوهش جدیدی که در Nature Biotechnology منتشر شده، یک روش نوآورانه برای تولید سریع و مقرون‌به‌صرفه pegRNAهای بلند و اصلاح‌شده شیمیایی ارائه کرده است.
این روش بر اساس یک تکنیک بهینه‌شده به نام Splint Ligation انجام می‌شود که به کمک آن، RNAهایی با طول بیش از ۱۲۵ نوکلئوتید و حتی تا ۱۹۰ نوکلئوتید با کارایی بسیار بالا تولید می‌شوند. در واقع Splint Ligation یک روش بیوشیمیایی است که برای اتصال دو قطعه RNA به هم به شرح زیر استفاده می‌شود.
سنتز قطعات RNA: قطعات RNA موردنظر (مثلاً یک RNA با ۳۲ نوکلئوتید و دیگری با ۸۲ نوکلئوتید) از قبل سنتز شده و به‌صورت جداگانه آماده می‌شوند. یکی از این قطعات دارای P۵‘ و دیگری دارای OH 3’ است.
استفاده از اسپلینت DNA: یک قطعه کوتاه DNA به نام اسپلینت برای پایدارکردن و نزدیک‌کردن دو قطعه RNA به هم استفاده می‌شود. این DNA مکمل با نواحی انتهایی RNA است و باعث می‌شود که دو قطعه RNA در یک راستا قرار بگیرند.
اتصال RNAها با لیگاز T4: پس از قرارگرفتن RNAها در جای مناسب توسط اسپلینت DNA، آنزیم T4 RNA Ligase 2 به طور خاص بین P5′ یک قطعه RNA و OH 3′ قطعه دیگر اتصال برقرار می‌کند و یک RNA کامل و بلند تولید می‌شود.
در این پژوهش، شرایط مختلف مانند دمای اتصال، طول اسپلینت DNA، نسبت RNA به اسپلینت و مقدار لیگاز برای بهبود کارایی فرآیند اتصال بررسی و بهینه‌سازی شده‌اند. نتایج نشان می‌دهند که اتصال در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و استفاده از یک نسبت ۱:۱ بین RNA و اسپلینت DNA بهترین کارایی را به همراه دارد.
روش جدید علاوه بر این که هزینه‌های تولید را کاهش می‌دهد، کارایی ویرایش ژنی را در سیستم‌های تحویل RNA و پروتئین بهبود می‌بخشد. این دستاورد نه‌تنها راه را برای استفاده درمانی از Prime Editing در بیماری‌های ژنتیکی باز می‌کند، بلکه می‌تواند تاثیر بسزایی در تحقیقات علمی و کاربردهای صنعتی داشته باشد.
واژگان:
Prime editing: یک روش دقیق ویرایش ژنوم که مستقیماً توالی‌های DNA را با استفاده از یک سیستم اصلاح‌شده CRISPR بازنویسی می‌کند.
pegRNA (Prime Editing Guide RNA):
pegRNA راهنما در سیستم Prime Editing که شامل توالی هدفمند، قالب معکوس‌نویسی (RTT) و ناحیه اتصال پرایمر (PBS) است. pegRNA امکان ایجاد تغییرات دقیق در DNA بدون ایجاد شکست‌های دو رشته‌ای را فراهم می‌کند و نقش کلیدی در هدایت فرآیند ویرایش ژنوم دارد.
