درمانهای مبتنی بر RNA و اهمیت حذف dsRNA
موفقیت واکسنهای mRNA علیه کووید-۱۹ علاقه جهانی به درمانهای RNA را در زمینههایی چون واکسنهای عفونی، درمانهای ژنتیکی و پزشکی بازساختی افزایش داده است.
با اینکه mRNA میتواند تقریباً هر پروتئینی را بدون خطرات حاملهای ویروسی یا DNA-based بیان کند، فرآیند رونوشتبرداری مصنوعی (IVT) ناخالصیهای ایمنیزایی مانند RNA دو رشتهای (dsRNA) تولید میکند که باعث تحریک ایمنی و کاهش اثربخشی میشود.
نهادهای نظارتی مانند EMA و FDA اهمیت کنترل dsRNA را تایید کردهاند، اما هنوز استانداردهای قطعی تعیین نکردهاند.
با تمرکز بیشتر بر فناوری mRNA پس از پاندمی covid-19، بررسی روشهای مؤثر حذف dsRNA ضرورت یافته است.
ضرورت بهینهسازی IVT و استفاده از رویکردهای چندمرحلهای
برای کاهش هزینههای تولید و جلوگیری از نیاز به پالایشهای سنگین، باید ابتدا فرآیند IVT برای کاهش تولید dsRNA بهینه شود. حتی پس از بهینهسازی فرآیند IVT، مقادیری از RNA دو رشتهای (dsRNA) همچنان باقی میماند.
ترکیب راهکارهای بالادستی مانند تغییر باز یوریدین و روشهای پاییندستی نظیر RPIP-HPLC، موثرترین نتایج را در حذف این آلاینده فراهم میکند.
پلیمرازهای مهندسیشده میتوانند سطح dsRNA را کاهش دهند، اما حذف کامل آنها نیازمند رویکردهای ترکیبی و چندمرحلهای است.
استاندارد طلایی جداسازی dsRNA از ssRNA؛ RPIP
کروماتوگرافی RPIP اولین روش موفق جداسازی dsRNA از ssRNA پس از IVT بود که خلوص mRNA را بهبود و بیان پروتئین را تا هزار برابر افزایش داد.
این روش بر پایه تفاوتهای آبگریزی عمل میکند و در حذف dsRNAهای بلند مؤثر بوده، اما جداسازی کامل dsRNA آنتیسنس همچنان چالشبرانگیز است.
محدودیتهای عملیاتی RPIP شامل فشار و هزینه بالا، خطر تخریب mRNA است که کاربرد آن را در مقیاس بالا، چالشبرانگیز میکند.
پتانسیل و چالشهای کروماتوگرافی هیدروکسیآپاتیت (HAC)
کروماتوگرافی HAC که بر پایه تعامل فسفات-کلسیم عمل میکند، روشی امیدبخش برای جداسازی dsRNA و ssRNA ارائه میدهد. اما کاربرد آن در پالایش mRNA در فرایند IVT ، محدود باقیمانده است.
از جمله چالشهای این روش؛ آسیب RNA در دماهای بالا، بازیابی پایین و گرفتگی ستون است که نیاز به بهسازی دارد.
با اصلاح بافرها و حذف نیاز به DNase، کروماتوگرافی HAC میتواند جایگاه مناسبی در فرآیندهای صنعتی آینده پیدا کند.
مزایا و محدودیتهای استفاده از ریبونوکلئاز (RNase III)
ریبونوکلئاز III با تجزیه انتخابی dsRNA، خلوص mRNA را افزایش میدهد؛ اما حذف کامل این آنزیم، برای جلوگیری از واکنشهای ایمنی ضروری است و فرآیند را دشوارتر میکند.
برای کاهش خطر آسیب به ssRNA، استفاده از RNase III مقاوم به دما یا غیرفعالشده کاتالیتیکی پیشنهاد شده است.
مسیرهای آتی برای بهینهسازی حذف dsRNA
اولویت اول باید به بهینهسازی فرآیند IVT برای کاهش اولیه dsRNA اختصاص یابد.
درعینحال، توسعه روشهای جدید خالصسازی بهویژه برای بهبود حذف dsRNA در mRNAهای بلند، همچنان حیاتی است.
عبارت کلیدی:
Reversed phase-ion pairing chromatography(RPIP)
روشی بر پایهی کروماتوگرافی است که برای جداسازی RNA دو رشتهای (dsRNA) از RNA تکرشتهای (ssRNA) پس از فرایند (IVT) به کار میرود.
این روش، بر تفاوت آبگریزی بین dsRNA و ssRNA تکیه دارد و به طور مؤثری ناخالصیهای ایمنیزا را حذف کرده، و بیان پروتئین را در سلولها افزایش میدهد.
𝐑𝐞𝐦𝐨𝐯𝐢𝐧𝐠 𝐢𝐦𝐦𝐮𝐧𝐨𝐠𝐞𝐧𝐢𝐜 𝐝𝐨𝐮𝐛𝐥𝐞-𝐬𝐭𝐫𝐚𝐧𝐝𝐞𝐝 𝐑𝐍𝐀 𝐢𝐦𝐩𝐮𝐫𝐢𝐭𝐢𝐞𝐬 𝐩𝐨𝐬𝐭 𝐢𝐧 𝐯𝐢𝐭𝐫𝐨 𝐭𝐫𝐚𝐧𝐬𝐜𝐫𝐢𝐩𝐭𝐢𝐨𝐧 𝐬𝐲𝐧𝐭𝐡𝐞𝐬𝐢𝐬 𝐟𝐨𝐫 𝐦𝐑𝐍𝐀 𝐭𝐡𝐞𝐫𝐚𝐩𝐞𝐮𝐭𝐢𝐜𝐬 𝐩𝐫𝐨𝐝𝐮𝐜𝐭𝐢𝐨𝐧: 𝐀 𝐫𝐞𝐯𝐢𝐞𝐰 𝐨𝐟 𝐜𝐡𝐫𝐨𝐦𝐚𝐭𝐨𝐠𝐫𝐚𝐩𝐡𝐲 𝐬𝐭𝐫𝐚𝐭𝐞𝐠𝐢𝐞𝐬
