ملکولmRNA  به‌عنوان یک بستر درمانی نوظهور، وابستگی بالایی به ساختار ۵′ Cap دارد؛ بخشی که هم برای شروع ترجمه پروتئین ضروری است و هم نقش کلیدی در فرار از شناسایی توسط سیستم ایمنی ذاتی ایفا می‌کند. با این حال، در فرآیند تولید و حتی طی نگهداری، این ساختار می‌تواند دچار تغییرات و تخریب‌های شیمیایی شود که پیامد آن ایجاد ناخالصی‌هایی نظیر مولکول‌های بدون Cap یا انواعی از mRNAها با Cap تخریب‌شده است. این ناخالصی‌ها می‌توانند به‌طور مستقیم بر کارایی و ایمنی محصولات دارویی بر پایهmRNA  اثر بگذارند و بنابراین به‌عنوانCritical Quality Attribute (CQAs)  مطرح می‌شوند.

در یک مطالعه تحلیلی گسترده، با به‌کارگیری Orthogonal LC–MS و مبتنی بر دو مسیر آنزیمی RNaseH و RNaseT1، پروفایل ناخالصی‌های Cap به‌دقت مشخص شد. این روش‌ها با استفاده از هضم آنزیمی و جداسازی کروماتوگرافی امکان شناسایی دقیق انواع مختلف ناخالصی‌ها از جمله mRNAهای بدونCap، گونه‌های حاوی نوکلئوتید اضافه در انتهای ۵′ و محصولات ناشی از تخریب شیمیایی Cap را فراهم کردند. یافته‌ها نشان دادند که شرایطی نظیر pH بالا، دمای افزایش‌یافته و حضور ترکیباتی مانند Mg²⁺ و اسپرمیدین سرعت تخریب Cap را افزایش می‌دهند. مهم‌تر آنکه حتی فرآیندهای تحلیلی نیز به دلیل نیاز به هضم آنزیمی یا کروماتوگرافی در دمای بالا، می‌توانند خود منجر به تخریب بیشتر Cap شوند و همین نکته ضرورت استفاده از استانداردهای مرجع را برای حصول اطمینان از صحت نتایج برجسته می‌کند.

ارزیابی کارکردی این ناخالصی‌ها نشان داد که افزایش میزان mRNAهای بدون Cap منجر به کاهش بیان پروتئین و فعال‌سازی قوی سیستم ایمنی ذاتی می‌شود. در مقابل، گونه‌های تخریب‌شده Cap گرچه موجب افت بیان پروتئین و کاهش توان دارو می‌شوند، اما تحریک ایمنی قابل توجهی ایجاد نمی‌کنند. این نتایج به روشنی بیانگر آن است که کنترل سطح ناخالصی‌های Cap باید بخشی اساسی از راهبردهای توسعه، بهینه‌سازی فرآیند و تضمین کیفیت mRNAهای درمانی باشد.

به‌طور کلی، درک عمیق‌تر از مسیرهای تخریب Cap و به‌کارگیری روش‌های تحلیلی دقیق مانند LC-MS نه تنها به شناخت بهتر پایداری و عملکرد mRNA کمک می‌کند، بلکه مسیر توسعه فرمولاسیون‌های پایدارتر و ایمن‌تر را نیز هموار می‌سازد. این یافته‌ها تأکید می‌کنند که حفظ تمامیت Cap و پایش مداوم ناخالصی‌های آن برای تضمین اثربخشی و ایمنی محصولات mRNA امری حیاتی است.

مرجع

https://doi.org/10.1016/j.omtn.2025.102570

تصویر: در شرایط بهینه‌ی co-transcriptional capping، در کنار ساختار درست Cap-1، مقادیر قابل‌تشخیصی از رونوشت‌های  بدون Cap ظاهر می‌شوند که پایش آن‌ها برای کنترل کیفی الزامی است.