پژوهشگران سیستم دو مدلی CRISPRa/i را معرفی کرده‌اند که امکان کنترل دقیق و همزمان فعال‌سازی و مهار ژن‌ها را در باکتری Escherichia coli فراهم می‌کند. این فناوری با ترکیب نسخه تکامل‌یافته dxCas9 (دارای انعطاف‌پذیری بیشتر در تشخیص توالی PAM) با پروتئین تنظیم‌کننده سلولی cAMP receptor protein (CRP) مهندسی‌شده، قابلیت هدف‌گیری گسترده‌تر و تنظیم دقیق بیان ژن را بهبود می‌بخشد. به کمک بهینه‌سازی ساختاری و اتصال‌های مختلف بین dxCas9 و CRP، این سیستم توانسته با ساماندهی توانمند نواحی تنظیمی بالادست ژن‌ها، همزمان توالی‌های کدکننده را مهار و فعال کند.

ویژگی‌های کلیدی سیستم

• فعال‌سازی چندگانه و مهار دقیق توأمان با چهارچوبی قابل برنامه‌ریزی
• استفاده از dxCas9 با دامنه هدف گسترده (شناسایی انواع توالی PAM: NGG، NG، GAA  و GAT)
• واریانت‌های CRP با قابلیت تعامل بهینه با ماشین‌آلات رونویسی شامل سه ناحیه فعال‌کننده  AR1،AR2  و AR3
• توانایی عملکرد در سطح ژنوم و پلاسمید

کاربرد آزمایشی در مسیر متابولیکی ویولاسین

با استفاده از کتابخانه‌های گسترده RNA راهنما (gRNA) برای فعال‌سازی و مهار همزمان ۳۶۴۰ ژن، سیستم در مقیاس ژنومی بهینه‌سازی مسیر تولید ویولاسین در E. coli را امکان‌پذیر ساخت و اهداف کلیدی (مانند rluC برای فعال‌سازی و ftsA برای مهار) که نقش مهمی در افزایش تولید دارند، را شناسایی کرد. ترکیب فعال‌سازی و مهار این ژن‌ها به افزایش بیش از ۳.۷ برابری تولید ویولاسین انجامید.

مزایا و قابلیت ها

• همزمانی فعال‌سازی و مهار ژن‌ها به صورت هدفمند
• قابلیت گسترش کاربرد به گونه‌های مختلف باکتریایی از جمله  Pseudomonas putida
• عدم تأثیر منفی بر روی رشد باکتری و بار سلولی پایین
• یک پلتفرم مقیاس‌پذیر برای مهندسی مسیرهای متابولیکی پیچیده و برنامه‌ریزی بیان ژن

 چشم‌اندازها و اهمیت

این سیستم دو حالته CRISPRa/i امکان کنترل دقیق و تعادل‌دار بیان ژنی در باکتری را فراهم می‌آورد و می‌تواند به ابزاری کارآمد برای مهندسی متابولیکی، مطالعه شبکه‌های ژنی و توسعه زیست‌کارخانه‌های میکروبی برای تولید محصولات دارویی، سوخت‌های زیستی و ترکیبات باارزش تبدیل شود. انعطاف‌پذیری این سیستم در انواع باکتری‌ها به طوری که حتی در گونه‌های متفاوت مانند Pseudomonas putida نیز بدون کاهش کارایی فعال‌سازی یا مهار ژن قابل استفاده باشد از اهمیت بالایی برخوردار است.

اصطلاحات کلیدی

• :Dual-mode CRISPRa/i سیستم CRISPRی که همزمان قادر به فعال‌سازی (CRISPRa) و مهار (CRISPRi) ژن‌ها است.
• dxCas9: نسخه بهینه شده Cas9 با دامنه هدف وسیع.
• CRP: پروتئین تنظیم‌کننده cAMP در E. coli که به عنوان دامنه اثرگذار برای فعال‌سازی رونویسی استفاده شده است.
• gRNA: RNA راهنما برای هدف‌گیری توالی DNA مقصد.

مرجع

https://doi.org/10.1093/nar/gkaf818