نویسنده: محمد امین جبل عاملی

در سال‌های اخیر، سلول‌درمانی پیشرفت زیادی در درمان سرطان داشته و یکی از روش‌های نوین آن استفاده از سلول‌های کشنده طبیعی مهندسی‌شده (CAR-NK) است. این سلول‌ها با ترکیب توانایی ذاتی نابود کردن سلول‌های سرطانی و گیرنده‌های خاص برای شناسایی هدف، می‌توانند به‌صورت محصولات آماده مصرف (off-the-shelf) تولید و سریع در اختیار بیماران قرار گیرند.

تولید سلول‌های CAR-NK به‌صورت برون‌تنی با چند مرحله ی مشخص آغاز می‌شود: ابتدا از خون محیطی، سلول‌های تک‌هسته‌ای (PBMCs) با استفاده از گرادیان چگالی Ficoll–Paque جدا می‌شوند؛ در این مرحله نمونه ی رقیق‌شده تحت سانتریفیوژ قرار گرفته و لایه ی حاوی PBMC بین پلاسما و فیکول جمع‌آوری می‌گردد. پس از شست‌وشوهای پی‌درپی برای حذف پلاسما و پلاکت‌ها، نوبت به خالص‌سازی سلول‌های NK می‌رسد: با روش‌های ایمونومغناطیسی ابتدا سلول‌های CD3+ حذف (depletion) و سپس سلول‌های CD56+ غنی‌سازی می‌شوند تا خلوص ≥۹۰٪ حاصل گردد؛ این گام کلیدی کیفیت نهایی محصول را تعیین می‌کند.

پس از جداسازی، سلول‌های NK فعال‌سازی می‌شوند که می‌تواند به‌صورت «feeder-cell-based» (کشت مشترک با سلول‌های تغذیه‌کننده مانند K562) یا «feeder-free» محرک‌های شیمیایی مانند(PMA/Ionomycin)  انجام شود. فعال‌سازی مناسب باعث افزایش کارایی انتقال ژن می‌شود. انتقال ژن CAR معمولاً با وکتور لنتی‌ویروسی انجام می‌شود؛ تکنیک‌هایی مانند پوشش سطحی با retronectin و فرآیند اسپین‌وکولاسیون برای افزایش نرخ ترانسداکسیون به کار می‌روند.

مرحله تکثیر (expansion) حساس‌ترین بخش است: سلول‌های ترانسدوس‌شده در محیط‌های حاوی سایتوکاین‌های  IL-2، IL-15 و IL-21 به‌مدت ۱۰–۱۴ روز کشت می‌شوند. برای دستیابی به بازده بالا و حفظ زنده‌مانی در چگالی‌های زیاد از سیستم‌های گاز-پذیر مانند G-Rex  استفاده می‌شود که امکان رشد طولانی و کارآمد سلولی را فراهم می‌کند.(شکل ۲)

محصول نهایی پیش از استفاده یا فریز در نیتروژن مایع، تحت آزمون‌های کنترل کیفیت قرار می‌گیرد: بررسی زنده‌مانی، خلوص سلولی (CD3−CD56+)، درصد بیان CAR (فلوسیتومتری)، و آزمون‌های عملکردی شامل کشندگی در برابر سلول‌های هدف (cytotoxicity assays)، اندازه‌گیری دگرانولاسیون (CD107a) و تعیین ترشح سایتوکاین‌ها IFN-γ)، (TNF-α . علاوه بر این، معیارهای پذیرش مرحله‌ای برای زنده‌مانی و عملکرد تعریف می‌شوند تا ایمنی و اثربخشی تضمین شود.

به‌طور کلی، فرآیند تولید CAR-NK ترکیبی از فناوری‌های زیستی پیشرفته، مهندسی ژنتیک، و کنترل کیفی دقیق است که از مرحله جداسازی سلول‌های خون تا تولید محصول نهایی ادامه می‌یابد. پیشرفت‌های اخیر در بهینه‌سازی این مراحل، زمینه را برای تولید گسترده و بالینی سلول‌های CAR-NK به‌عنوان درمان‌های ایمن، مقرون‌به‌صرفه و قابل دسترس فراهم کرده است.

مرجع

۱۰.۳۳۹۰/mps8050102

شکل۱:  شماتیک مراحل تولید ex vivo سلول‌های CAR-NK انسانی با استفاده از خون محیطی
شکل ۲: پلتفرم تولید G-Rex® که به‌طور ویژه برای تولید سلول‌های ایمنی مانند سلول‌های T، سلول‌های کشنده طبیعی (NK) و سلول‌های خونساز طراحی شده است.