روش‌های ارزیابی کیفیت :RNA
رونویسی آزمایشگاهی (IVT) یک واکنش مهم در زمینه درمان‌ها و اکسن‌های مبتنی بر RNA است که بر اساس آن می توان مقدار و کیفیت محصول RNA ی تولید‌شده را مورد ارزیابی قرار داد.
به طور معمول روش‌هایی نظیر الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید و آگارز و یا الکتروفورز مویینه و نیز کروماتوگرافی‌مایع با کارایی بالا (HPLC) برای تجزیه‌وتحلیل کیفیت و مقدار RNA استفاده می‌شوند.
این روش‌ها برای سنجش مقدار و کیفیت RNA ی تولیدی در نقطه‌پایانی فرآیند رونویسی به کار برده می‌شوند و به‌صورت Real-time یا نزدیک به Real-time ( آنی و شبه آنی ) هم نیستند.
چه روش‌هایی برای سنجش‌آنی بیان‌آزمایشگاهی RNA ها وجود دارد؟
این روش‌ها که به‌صورت آنی و یا نزدیک به شرایط آنی به پایش نتایج IVT می‌پردازند شامل سه دسته کلی می‌شوند.
استفاده از آپتامرهای نورافزا و رنگ‌های فلورسانس
استفاده از پروب‌های آنتی‌سنس نشاندار شده با فلوروفور‌ها
روش مبتنی بر HPLC
پایش آنی IVT با استفاده از آپتامرهای نورافزا (light-up) و رنگ‌های فلورسانس:
این آپتامرها قادرند با فلوروژن‌های غیر فلورسانت پیوند یافته و آن‌ها را فعال کنند، که به عنوان آپتامرهای “نورافزا” یا (light-up)شناخته می‌شوند.
این روش امکان تصویربرداری و پایش RNA را با استفاده از ماژول‌های فلورسنس یونیورسال (UFM) و یا به‌کارگیری روش FRET فراهم می‌کنند.
استفاده از پروب‌های آنتی سنس نشاندار شده با فلوروفور‌ها برای پایش آنی :IVT
در این رویکرد از پروب‌هایی استفاده می‌شود که با اتصال به RNA هدف، سیگنال فلورسانس تولید یا افزایش می‌یابد.
روش‌های بر پایه پروب می‌توانند شامل به‌کارگیری پروب‌های DNA نشاندار با رنگ‌های افزایش دهنده فلورسانس، استفاده از Beacon های مولکولی (MB)، پروب BFQ و یا پروب های Locked Nucleic Acid (LNA) باشند.
روش پایش IVT مبتنی بر :HPLC
در مطالعات اخیر، یک استراتژی “At-line” مبتنی بر HPLC برای پایش IVT در نقاط زمانی خاص توسعه‌داده‌شده است.
در این روش، نمونه IVT در زمان‌معین متوقف شده و برای آنالیز به HPLC تزریق می شود. که امکان اندازه‌گیری هم‌زمان اجزای IVT از جمله نوکلئوتید‌ها، پلاسمید، عوامل کپینگ (capping) و RNA را با تاخیر‌حداقلی فراهم می‌سازد.
چه روش‌هایی برای بهبود پایش IVT وجود دارد؟
روش‌های طیف‌سنجی نیز می‌توانند برای تقویت روش‌های پایش IVT به صورت آنی به کار گرفته شوند.
استفاده از طیف‌سنجی رامان با توانایی پایش‌میزان‌نوکلئوتید‌مصرفی، دورنگ‌نمایی دایره ای (CD) و نیز طیف‌سنجی مادون قرمز (IR) با بررسی تغییرات ساختار RNAی تولید شده می‌توانند به پایش آنی IVT کمک نمایند.
پایش آنی IVT با استفاده از استراتژی‌های مختلف می‌تواند به بهبود فرآیندهای تولید RNA کمک کند.
هم چنین استفاده‌ترکیبی از این روش‌ها می‌تواند به دقت بیشتر و افزایش‌کارایی در تولید RNA برای کاربردهای درمانی و واکسن‌های بر پایه RNA منجر شود.
عبارات کلیدی:
IVT /In Vitro Transcription: به معنای رونویسی درون‌لوله‌ای است. در این فرآیند، RNA به‌صورت مصنوعی و خارج از سلول (در شرایط آزمایشگاهی) با استفاده از آنزیم‌هایی مانند پلیمراز T7 از روی قالب DNA سنتز می‌شود.
At-line: به روش‌هایی گفته می شود که نمونه‌برداری در حین فرآیند انجام شده، ولی تحلیل آن خارج از خط تولید (اما نزدیک در همان محل) و بلافاصله بعد از نمونه‌گیری انجام می‌شود.
𝐑𝐞𝐚𝐥-𝐭𝐢𝐦𝐞 𝐦𝐨𝐧𝐢𝐭𝐨𝐫𝐢𝐧𝐠 𝐬𝐭𝐫𝐚𝐭𝐞𝐠𝐢𝐞𝐬 𝐟𝐨𝐫 𝐨𝐩𝐭𝐢𝐦𝐢𝐳𝐚𝐭𝐢𝐨𝐧 𝐨𝐟 𝐢𝐧 𝐯𝐢𝐭𝐫𝐨 𝐭𝐫𝐚𝐧𝐬𝐜𝐫𝐢𝐩𝐭𝐢𝐨𝐧 𝐚𝐧𝐝 𝐪𝐮𝐚𝐥𝐢𝐭𝐲 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐨𝐟 𝐑𝐍𝐀
