مکانیزمهای تعمیر دو رشتهای (DSB) و زیرمسیرهایی مانند MMEJ نقش تعیینکنندهای در نتیجه ویرایش ژنی با CRISPR–Cas دارند و میتوانند باعث حذفهای ناخواسته یا درجهای نامنظمی شوند که بازده و صحتِ درج ترانسژنها را کاهش میدهد. برای غلبه بر این محدودیت، نویسندگان یک راهکار مهندسیشده مبتنی بر «تکرارهای کوتاه میکروهومولوژی (µH) بهصورت تاندِم» در لبههای قالب ترانسژن پیشنهاد میکنند؛ هدف این است که مسیر ترمیم را به سمت استفاده از µH هدایت کرده و در نتیجه درجهای in-frame با حداقلِ تراش و حذف، افزایش یابد.
این تیم از پیشبینیهای مبتنی بر یادگیری عمیق نیز بهره برد تا طراحیِ عقلانی بازوهای ترمیم را ممکن سازد: با استفاده از مدل inDelphi بهعنوان پایه، چارچوب محاسباتی جدیدی به نام Pythia توسعه یافت که “ماتریسهای Pythia” برای ترکیبها و طولهای مختلف µH تولید میکند و بر اساس آن امتیازی برای پیشبینی کارایی درج یا اصلاحِ نقطهای ارائه میدهد. همبستگی قابلتوجه بین پیشبینیهای Pythia و نتایج تجربی، اعتبار این روش طراحی را پشتیبانی میکند.
آزمایشهای in vitro در سلولهای HEK293T و مطالعات in vivo در Xenopus tropicalis و مغز موش بالغ نشان دادند که µH تاندِم میتواند درجِ تکنسخهای جهتدار، برچسبگذاری اندوژن و حتی اصلاحات کوچک را در بافتهایی که HDR ناکارا است، تسهیل کند؛ اگرچه بازدههای مطلق بسته به سیستم متفاوت و در برخی موارد پایین است، اما کیفیت junction ها، حفظِ قابِ درج و کاهشِ حذفهای ناخواسته بهطور معنیداری بهتر شد.
علاوه بر درج کاسِتهای بزرگ، کاربرد این چارچوب برای طراحی ssODNهای کوچک نیز نشان داده شد؛ نمونههایی مانند تبدیل eGFP→eBFP با طراحیهای Pythia بازده مناسبی داد و همبستگی اسپیرمن میان پیشبینی و بازده تجربی نشاندهنده قابلیت پیشبینیپذیری روش است.
نویسندگان همچنین قواعد عملی برای طراحی پیشنهاد کردند از جمله انتخاب gRNA و ویژگیهای توالی محلی که میتوانند احتمال درج مطلوب را افزایش دهند؛ و محدودیتهای روش را صریحاً عنوان کردند از جمله وابستگی به ایجاد DSB که ممکن است مسیرهای سلولی مانند p53 را فعال کند، ریسک آفتارگت و رویدادهای ساختاری پیچیده که نیازمند پیشآزمایش، کنترلهای دقیق و ارزیابی ایمنی است.
در مجموع، ترکیب µH تاندِم با پیشبینیهای یادگیریعمیق (Pythia) یک چارچوب عملی و قابلپیشبینی برای درجهای ژنومی دقیق، برچسبگذاری اندوژن و اصلاحات نقطهای فراهم میآورد که میتواند در پژوهش پایه، مدلسازی عملکرد پروتئین و توسعه رویکردهای درمانی ژنی کاربردی باشد؛ دادهها، ابزارها و کدهای مرتبط بهصورت عمومی در دسترس قرار گرفتهاند تا محققان بتوانند این روش را در زمینههای مختلف بهکار گیرند.
مرجع
https://doi.org/10.1038/s41587-025-02771-0
پیشبینی ترمیم DNA با CRISPR-Cas9 را در مرز ژنوم-اهداکننده با inDelphi نشان میدهد.
(a) افزودن تکرارهای ۳-bp µH repair را از ۰ به ۶۲.۲% افزایش میدهد
(b) شبیهسازی ۲۵۰هزار gRNA، plateau در حدود ۵ تکرار
(c) هیتمپ وابستگی زمینه برای µH ۲-۴ bp در ۲۵ gRNA
